自Ash和Knoll等创立表面等离子体共振成像( Surface Plasmon Resonance Imaging, SPR I)技术以来, 使得生物分子点阵的无标记并行检测成为可能. 迄今为止, SPR I主要采用单波长激发光源, 检测到的是单色或黑白图像. 虽然利用多波长激发光源进行SPR I研究具有许多优势(比如彩色图像鲜艳动人及信息含量高等) , 并在金属膜等研究中有所应用, 但在分子类样品中的研究应用的报道则很少, 原因可能在于没有商品仪器且彩色信号复杂、分析难度大等方面. 为了探索其中的问题,并促进SPR I新方法的建立和发展, 我们自主设计并建立了彩色表面等离子共振成像(Color SPR I,CSPR I)实验系统, 并结合利用自己编制的软件开展了相关研究, 成功地观测到溶液和蛋白点阵的彩色图像. 这些结果显示, CSPR I有可能成为生物分子微点阵(或生物芯片)的一种新型的彩色显示手段.

      1　实验部分

      1. 1　试剂与仪器

      巯基十一酸(Mercap toundecanoic acid, MUA)购自Aldrich公司(Milwaukee, USA) ;氮2羟基琥珀酰亚胺(N 2Hydroxysuccinimide, NHS)购自Acros公司(New Jersey, USA) ; 氮2乙基2氮′2 (二甲氨丙基) 碳二亚胺[ N 2Ethyl2N′2 ( dimethyaminop ropyl) carbodiimide, EDC ]购自Avocado ResearchChemicals Ltd. (Lancashire, UK) ; 牛血清白蛋白(BSA)购自北京拜尔迪生物技术有限公司; 乙醇胺、无水乙醇及其它分析纯试剂均购自北京化学试剂公司; 实验用水为3次蒸馏水; 金膜采用真空喷镀法在玻璃基底(折射率n = 11516)上镀制而成, 膜厚约50 nm.

      自行研制的CSPR I仪器的示意图见图1, 其中的光源是卤钨灯, 它所发出的复色光经过透镜和偏振片后, 扩展成一束平行偏振入射光; 分析单元由玻璃棱镜(折射率n = 11516) 、金膜和样品池组成, 整体固定在一个能精密调节入射光在棱镜底部的入射角度的旋转台上; 金膜通过香柏油( n =1151)粘接在棱镜底部, 镀金面朝向样品池, 金膜和样品池体之间用密封垫密封. 信号检测部分包括彩色CCD (WAT2231S,日本Watec公司) 、焦平面调节透镜和图像采集卡(OK_C30A, 北京嘉恒中自图像技术有限公司). 图像由微机记录并显示.

      SPR仪器: 波长询测SPR光谱仪也由本实验室设计构建.

      1. 2　实验过程

      成像实验基本操作: 当入射光从棱镜的一侧导入照射在棱镜底部的金膜背面时, 调节旋转平台, 使入射光满足反射条件以形成共振吸收; 将待测样品导入样品池, 进而微调入射光角度, 使所记录图像清晰. 把检测到的图像信号储存,以待后续分析.

      样品测定: 将样品溶液直接注入到样品池中或使其流过金膜表面, 调节入射角, 实时记录图像.

      微点阵样品测定: 以BSA样品为例叙述. (1) 将BSA溶解在10 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH =714)中, 配制成015 mg/mL溶液; (2) 在金膜表面自组装一层MUA膜, 然后将其浸入NHS和EDC的混合液中, 使MUA末端的羧基活化; (3) 采用实验室自制的点样仪, 把BSA溶液直接点在经修饰后的金膜表面上, 由于BSA末端氨基与金膜表面活化的酯基发生氨基偶联反应而形成键合微点阵;(4) 用盐酸乙醇胺溶液浸泡传感膜, 以封闭微点阵周围背景处未发生偶联反应的酯基; (5) 依次用磷酸盐缓冲溶液和水清洗传感膜表面, 除去非键合吸附的BSA和乙醇胺, 用N2 气吹干, 将其安装在CSPR I仪上, 调节入射角, 实时记录图像.

      SPR吸收光谱测定: 把金膜安装在SPR光谱仪上, 调整入射角, 以空气谱作参比光谱, 将样品溶液泵入样品池, 实时记录SPR光谱.

      2　结果与讨论

      2. 1　溶液的表面等离子体共振吸收彩色

      利用CSPR I系统考察了一些纯溶液样品的彩色成像. 图2显示的是水和乙醇在不同入射光角下测得的图像色彩, 可见有非常明显的区别. 该信号提示, 利用CSPR I技术可以根据颜色的不同和变化, 对样品进行直观的鉴别.

       2. 2　彩色成像分析

       CSPR I图像的色彩源于表面等离子体共振吸收, 对应于吸收波长的互补色 .

       图3显示了乙醇和水的SPR共振波长随入射角的变化, 比较图2和图3可见, 随着样品的折射率和入射角的不同, 吸收波长会发生改变, 因而图像的颜色会发生相应的变化. 比如, 在入射角等于74. 86°时, 乙醇的吸收波长是658 nm, 故显深绿色, 而水的吸收波长为603 nm, 故显蓝色. 又如当入射角为77. 71°时, 乙醇和水的共振波长分别移至621 和583 nm, 其图像色彩也相应地变为绿蓝色和紫色.

      2. 3　蛋白点阵的彩色成像

      通过溶液的彩色成像实验可见, CSPR I可被用于样品微点阵的彩色成像研究和显示. 为此, 以BSA为对象进行了研究, 结果如图4所示. 很明显, 样点与背景的颜色显著不同, 由此可以非常直观地判别出金膜上键合的蛋白样点. 与水和乙醇的实验类似, BSA点阵的色彩随着入射角的改变而变化. 结果表明, CSPR I不仅可用于各种溶液的成像研究, 也可用于样品点阵的直观鉴别研究. 如果结合分子识别探针阵列, 有可能将CSPR I开发成一种全新的彩色图像分析方法, 成为一种类似于DNA芯片的彩色分析新方法. 对此有待深入研究.